Диплом на тему: Получение трансгенных растений рапса, устойчивых к засолению и повышенному содержанию тяжелых металлов
Фиторемедиация является одним из новейших направлений генной инженерии. Трансгенные растения могут использоваться для очистки почв, грунтовых вод от загрязнителей: тяжелых металлов, радионуклидов и др. Методом генной трансформации можно увеличить устойчивость растения к повышенному содержанию тяжелых металлов в почве, тем самым, расширив возможности его применения на сильнозагрязненных территориях. Это осуществляется путем конструирования in vitro функционально активных генетических структур, содержащих гены различных организмов, и введения таких конструкций в геном растения.
Цель работы:
• получение растений рапса со встроенным геном MyB 4 и изучение их реакций на абиотический стресс – повышенные концентрации солей ТМ: цинка и меди;
• сравнение полученных результатов с аналогичными показателями у нетрансгенных растений рапса и выводы относительно эффективности применяемого гена с целью увеличения устойчивости к повышенным концентрациям солей меди и цинка;
• определение возможности использования полученного трансгенного рапса в сельском хозяйстве при фиторемедиации загрязненных земель.
Задачи:
1. Получить культуру клеток Agrobacterium tumefaciens, несущих ген Myb 4.
2. Протрансформировать экспланты рапса на агробактериальном газоне.
3. Получить каллус и жизнеспособные регенеранты с него.
4. Пересадить регенеранты на питательную среду и вырастить растения.
5. Проверить их методом ПЦР на наличие гена Myb 4.
6. Полученные растения выращивать при разных концентрациях солей меди и цинка.
7. Провести физиологические опыты с нетрансгенным рапсом, чтобы изучить особенности развития растений данного вида в условиях повышенных концентраций этих металлов:
a. установить в нескольких временных точках содержание ионов меди и цинка в листьях растений, выращенных на разных концентрациях солей.
b. определить в динамике содержание пролина и оводненность тканей растений при разных условиях выращивания.
8. После получения необходимого количества семян трансгенных растений провести аналогичные опыты с трансгенами, чтобы сравнить полученные результаты и сделать выводы.
В качестве объекта трансформации выбран рапс (лат. Brassica napus ssp. oleifera) сорта Вестар (Westar).
Рапс — важное масличное растение из семейства Крестоцветных. В диком виде он не встречается, в культуре известен за 4 тыс. лет до н. э. Рапс произошёл от скрещивания озимой или яровой сурепицы (В. campestris) с капустой огородной (В. oleracea).
Рапс является двудольным растением, поэтому хорошо заражается агробактерией. Он является одним из классических объектов генной инженерии, методики его трансформации достаточно хорошо проработаны.
В качестве встраиваемого гена выбран ген Myb 4, который отвечает за реакцию на разнообразные виды абиогенных стрессов. Оверэкспрессия этого гена приводила к повышению устойчивости к холоду, морозу и дегидратации (соли, засуха). В ответ на стресс растение накапливает осмолиты: пролин, аминокислоты, глицинбетаин, сахара.
Медь и цинк относятся к тяжелым металлам, но в малых количествах являются эссенциальными (то есть жизненно необходимыми для растений) элементами, вовлеченными во множество физиолого-биохимических процессов в живых организмах. Среди ТМ они наряду с никелем занимают особое место, поскольку их избыточное содержание в почве может быть результатом не только хозяйственной деятельности человека, но и естественных почвообразовательных процессов, так как эти металлы содержатся в высоких концентрациях в составе некоторых почвообразующих пород.
Идентификация генных конструкций в исследуемой ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.
Термостабильная ДНК-полимераза.
Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).
Буферный раствор.
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое быстрое охлаждение и нагревание пробирок по определенной программе, обычно с точностью не менее 0,1°С.
Навеску воздушно-сухого растительного материала (30-50 мг) заливали смесью концентированных азотной (1,5 мл) и хлорной (0,8 мл) кислот и оставляли на сутки. Затем с помощью аналогового термостата TDB-400-A фирмы BioSan пробы прогревали 3 часа при 180º и после охлаждения до 150º вносили в них по 5-6 капель концентрированной H2O2. Через 10 минут к пробам приливали 1 мл HCl и выдерживали их 10 минут при температуре 110º. После обесцвечивания растворов концентрацию ТМ измеряли на атомно-абсорбационном спектрофотометре Hitachi-207 фирмы Hitachi.
Экспериментальная часть
Работа проводилась параллельно в двух направлениях:
получение трансгенных растений;
физиологические опыты с растениями исходного сорта Вестар для последующего сравнения аналогичных результатов у трансгенов.
Растения рапса выращивались в фитотроне при t=20ºC и 18 часовом световом режиме при 70% влажности воздуха на питательной среде Хогланда-Снайдерс. Семена проращивали в перлите, затем пересаживали на водную культуру. Опыт проводился в водной культуре.
Трансформация рапса осуществлялась агробактериальным методом. Трансгены выращивались из регенерантов на каллусе. Отбор проводился на канамицине.
Было получено несколько трансгенных растений, из них выжило только одно. В настоящее время оно цветет, и в будущем планируется получить его семена. Выращенный из семян рапс будет также проверен на трансгенность методом ПЦР, а затем с ним будут поставлены те же опыты, что и с обычным рапсом сорта Вестар.
Параллельно с получением трансгенов, мы подбирали экспериментальные условия на растениях дикого типа, чтобы в дальнейшем повторить их с трансгенными растениями.
Физиологические опыты с растениями исходного сорта Вестар проводились для последующего сравнения аналогичных результатов у трансгенов.
Растения рапса выращивались в фитотроне при t = 20ºC и 18 часовом световом режиме при 70% влажности воздуха на питательной среде Хогланда-Снайдерс с модификациями.
Семена проращивали в перлите, затем пересаживали на водную культуру.
Опыт проводился в водной культуре
Ставилось 7 опытов с выращиванием рапса на повышенных концентрациях меди и цинка.
Состояние растений оценивалось по:
содержанию тяжелых металлов;
накоплению пролина;
оводненности листьев растений рапса.
Ставилось 7 опытов с выращиванием рапса на повышенных концентрациях меди и цинка.
Использовались различные концентрации металлов:
цинк – 1000, 2500, 5000 мкМ,
медь – 25, 100 мкМ.
Время воздействия – 5, 10, 15 дней.
Исследования содержания меди в листьях показали, что в течение времени оно слабо изменяется, то есть растение не позволяет меди накапливаться в надземных органах, её содержание никогда не превышало контроль более чем в 2,5 раза. При слишком высоких её концентрациях растение погибает.
С цинком обратная картина – рапс способен поглощать этот металл из почвы, накапливая его в надземных органах, и выживать даже при очень высоких его концентрациях. В этом случае развитие растения несколько тормозится, но не прекращается. Летальная концентрация цинка для рапса очень велика, т.е. рапс обладает высокой устойчивостью, а также характерно значительное накопление в надземных органах – до 7000, а в некоторых экспериментах и до 10 000 мкг/г сух. массы листа. При 5000 мкМ растение погибало, но успевало накопить в вегетативной массе огромное количество этого тяжелого металла.
При таких высоких значениях концентрации наблюдается сильное повреждение, но эффект намного ниже, чем у меди.
На рисунке видны характерные некрозы, вызванные высоким содержанием цинка в листьях.
Если умеренная концентрация цинка, при которой растения испытывают стресс, но не гибнут составляет 1000-2500 мкМ, то для меди эта концентрация – 25 мкМ, т.е. в 100 раз ниже, то есть медь является на 2 порядка токсичнее для рапса.
Для показателей оводненности характерно следующее: при действии меди сильнее изменяется водный статус и при более низких концентрациях, чем у цинка. Это также говорит о большей устойчивости рапса к цинку и о высокой токсичности для него меди.
Нарушение водного статуса могло означать, что должен накапливаться пролин, как совместимый осмолит – содержание пролина при максимальной концентрации меди превышает контрольные значения в 30 раз, тогда как для цинка – в 18 раз.
Повышение содержания пролина в тканях растения при стрессе говорит о его способности защищаться от неблагоприятных воздействий окружающей среды и выживать.
На графике видно, что медь является для рапса более сильным токсикантом. При концентрации в 100 мкМ вырабатывается больше пролина, чем при 5000 мкМ цинка, При 100 мкМ меди на 15 день выработка пролина прекращается, т.к. растение не справляется с данной нагрузкой и погибает.
При повышенных концентрациях цинка также увеличивается содержание пролина, но менее резко. При концентрациях 1000 мкМ и 2500 мкМ растение испытывает стресс, но справляется с ним. 5000 мкМ – опасная концентрация, способная привести к гибели, но все равно стресс меньше, чем при повышенном содержании меди.
Выводы
1. В результате проведенной работы было получено 4 трансгенных растения рапса (ген Myb 4). Жизнеспособным оказалось только одно растение.
2. Провести сравнительные исследования по устойчивости к повышенному содержанию ТМ не представлялось возможным, т.к. одного растения оказалось явно недостаточно. Поэтому на данном этапе работы проводились физиологические исследования на растениях сорта Вестар.
3. Не наблюдалось значительного накопления меди в надземной части растений ни при увеличении концентрации металла в среде, ни при увеличении длительности воздействия – содержание меди не превышало контрольные показатели более чем в 2,5 раза. Это говорит о том, что рапс является эксклюдером по отношению к меди, то есть не пропускает в клетки надземной части растения ионы меди;
4. Показано накопление значительного количества цинка в надземной части, причем максимальные абсолютные значения – до 7-9,9 мг/кг сух.массы - позволяют считать рапс гипераккумулятором цинка.
5. Благодаря своей мощной биомассе рапс может быть очень эффективным фиторемедиантом, то есть способен выносить из среды очень большие количества цинка;
6. Медь является значительно более сильным токсикантом для рапса, чем цинк. Летальная концентрация меди для рапса – 100 мкМ, для цинка – 5000 мкМ;
7. Наблюдалось снижение оводненности листьев рапса при действии тяжелых металлов, причем токсический эффект меди был выражен сильнее, чем цинка
8. Синтез пролина – одна из первых реакций на стресс. Пролин защищает структуру белков клетки от воздействия ионов солей (в.ч. солей ТМ) сразу после начала их воздействия, до того, как включатся другие механизмы адаптации. Пролин накапливался при действии обоих металлов – но содержание пролина при действии меди превышало контрольные показатели в 30 раз, тогда как при действии цинка – в 18 раз.
